Science Ticker

Im Science Ticker werden wissenschaftliche Artikel rund um das Thema Genome Editing kurz beschrieben. Es handelt sich um eine fortlaufende Sammlung an aktueller Literatur, die nicht den Anspruch auf Vollständigkeit erhebt und unregelmäßig ergänzt wird. Die Auswahl der Publikationen erfolgt anhand verschiedener Kriterien. Zum einen soll die Sammlung den rasanten Fortgang von Genome-Editing-Verfahren verdeutlichen, indem Artikel beschrieben werden, die neue Erkenntnisse zu den Grundlagen und der Weiterentwicklung der Anwendungen liefern. Zum anderen werden aktuelle Publikationen im Hinblick auf das Vorsorgeprinzip ausgewählt. Dabei wird sowohl Literatur aus dem medizinischen Bereich als auch zu pflanzlichen und tierischen Systemen berücksichtigt.

Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.

Diese Studie nutzt Whole Genome Sequencing (WGS) Methoden, um die Spezifität von sogenannten Base Editors im Reis zu analysieren. Es zeigte sich, dass CBE’s viel mehr ungewollte Veränderungen (C in T Umwandlungen) im Erbgut verursachten als die ABE’s und als in den Kontrollgruppen identifiziert wurden. Diese Veränderungen wurden über das gesamte Erbgut hinweg verteilt gefunden, vor allem angereichert in aktiv abgelesenen Gen-Bereichen. Interessanterweise zeigte sich, dass die ungewollten Veränderungen an willkürlichen Stellen des Genoms eingeführt wurden und nicht an Stellen, die durch Computerprogramme als mögliche off-target Bereiche prognostiziert wurden.

Jin, S., Zong, Y., Gao, Q., Zhu, Z., Wang, Y., Qin, P., Gao, C. (2019). Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. doi: 10.1126/science.aaw7166

Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos.

Diese Studie ist vom Versuchsaufbau her sehr elegant konzipiert. Die jeweiligen Komponenten der Base Editors werden in  eine von zwei Zellen im 2-Zell-Stadium des Maus-Embryos injiziert. Somit können nach einigen Zellteilungen Genom editierte und unveränderte Zellen mit demselben genetischen Hintergrund untersucht und miteinander verglichen werden. Hierbei zeigte sich bei der Sequenzierung des Erbguts (Whole Genome Sequencing, WGS), dass Zellen, die mit Cytosine Base Editors behandelt wurden,  20x mehr ungewollte Veränderungen im Erbgut hervorrufen als Adenin Base Editors und im Vergleich mit den Kontrollgruppen.

Jin, S., Zong, Y., Gao, Q., Zhu, Z., Wang, Y., Qin, P., Gao, C. (2019). Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. doi: 10.1126/science.aaw7166

The complex architecture and epigenomic impact of plant T-DNA insertions.

Mit Hilfe von neuen Sequenzierungsmethoden, die es ermöglichen, sehr große DNA-Bereiche des Erbguts zu entschlüsseln, ist es Wissenschaftlern gelungen, nach einer Agrobacterium-Transformation in Arabidopsis thaliana und T-DNA-Integration weit entfernte DNA-Regionen auf strukturelle Unregelmäßigkeiten und ungewollte Veränderungen der DNA-Sequenz hin zu untersuchen. Offenbar kann es bei der Integration der T-DNA dazu kommen, dass große Teile der pflanzlichen DNA ungewollt durch die T-DNA-Integration umgebaut und Inversionen, Deletionen und Insertionen im Erbgut hervorgerufen werden. Weiterhin konnten die Wissenschaftler zeigen, dass es zu Veränderungen von epigenetischen Markern im Bereich der Integrationsstelle der T-DNA kommen kann, was zu einer veränderten Genexpression führen kann.

Jupe, F., Rivkin, A. C., Michael, T. P., Zander, M., Motley, S. T., Sandoval, J. P., Ecker, J. R. (2019). The complex architecture and epigenomic impact of plant T-DNA insertions. PLoS Genet, 15(1), e1007819. doi: 10.1371/journal.pgen.1007819

CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors.

Delta-Proteobakterien, die im Grundwasser vorkommen, besitzen eine Cas-Variante, die unabhängig von den bisher am häufigsten verwendeten Genscheren Cas9 oder Cpf1 entstanden ist. Die neue Genschere CasX ist viel kleiner, erkennt eine charakteristische PAM-Sequenz (TTCN) auf dem Erbgut und hat strukturell bis auf eine Schneidekomponente nur wenig Ähnlichkeit mit den anderen beiden Genscheren. Dennoch haben alle drei dieselbe molekulare Wirkung: durch eine Erkennungskomponente, die guide RNA, wird eine Zielsequenz auf der DNA erkannt und von den Genscheren geschnitten. CasX schneidet, ähnlich wie Cas9, doppelsträngige DNA, jedoch wird die DNA nicht glatt zerschnitten, sondern es entstehen versetzte DNA-Enden. Es wird vermutet, dass hierdurch die Spezifität der Editierung erhöht wird. Im direkten Vergleich liegt die Effizienz in der Veränderung von Zielsequenzen durch Cas9 aber noch deutlich über der von CasX.

Liu, J. J., Orlova, N., Oakes, B. L., Ma, E., Spinner, H. B., Baney, K. L. M., Doudna, J. A. (2019). CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature. doi: 10.1038/s41586-019-0908-x

De novo domestication of wild tomato using genome editing.

In dieser Studie werden in einer wilden Tomatenart durch CRISPR/Cas9 sechs Gene verändert, die sich als wichtig für den Ertrag und den Nährstoffgehalt von domestizierten Tomaten erwiesen haben. Diese Wild-Tomaten tragen Eigenschaften wie Stress-Toleranz und Krankheitsresistenzen im Erbgut, die im Zuge der Zucht verloren gegangen sind. Durch die Editierung von sechs Genen wurden die Wild-Tomaten in ihrer Form, Größe, der Anzahl der Früchte und dem Nährstoffgehalt verändert.

Zsogon, A., Cermak, T., Naves, E. R., Notini, M. M., Edel, K. H., Weinl, S.,Peres, L. E. P. (2018). De novo domestication of wild tomato using genome editing. Nat Biotechnol.

Kinetics and Fidelity of the Repair of Cas9-Induced Double-Strand DNA Breaks.

Hier wird in menschlichen Zellen die Geschwindigkeit der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) modelliert, die durch CRISPR/Cas9 bewirkt wurden. Die Reparatur der DSB verläuft insgesamt recht langsam und führt überwiegend zu Veränderungen der Zielsequenz, anstatt den Normalzustand wiederherzustellen.

Brinkman, E. K., Chen, T., de Haas, M., Holland, H. A., Akhtar, W., & van Steensel, B. (2018). Kinetics and Fidelity of the Repair of Cas9-Induced Double-Strand DNA Breaks. Mol Cell, 70(5), 801-813 e806. doi: 10.1016/j.molcel.2018.04.016

Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome.

Nahezu vollständige Sequenzierung des Erbguts des hexaploiden Weizens durch das IWGSC (International Wheat Genome Sequencing Consortium). Diese Publikation liefert ein Referenzgenom der Weizen-Sorte Chinese Spring.

International Wheat Genome Sequencing, C., investigators, I. R. p., Appels, R., Eversole, K., Feuillet, C., Keller, B., Uauy, C. (2018). Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome. Science, 361(6403). doi: 10.1126/science.aar7191

RNA virus interference via CRISPR/Cas13a system in plants.

Hier wurde das CRISPR/Cas13a-System auf Tabakpflanzen übertragen, so dass die Pflanzen bei einer Infektion mit dem Turnip Mosaic Virus (TuMV) das virale Erbgut in Form von RNA erkennen und zerschneiden können. Das CRISPR/Cas13-System wurde hier zum ersten Mal dazu verwendet, Pflanzen zu entwickeln, die sich vor einem eindringenden RNA-Virus schützen können.

Aman, R., Ali, Z., Butt, H., Mahas, A., Aljedaani, F., Khan, M. Z., Mahfouz, M. (2018). RNA virus interference via CRISPR/Cas13a system in plants. Genome Biol, 19(1), 1. doi: 10.1186/s13059-017-1381-1

Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.

In diesem Artikel werden Verfahren, Werkzeuge und Marker vorgestellt, um das Erbgut in Bakterien, die mit Honigbienen und Hummeln assoziiert sind, zu verändern (das Mikrobiom).

Leonard, S. P., Perutka, J., Powell, J. E., Geng, P., Richhart, D. D., Byrom, M., Barrick, J. E. (2018). Genetic Engineering of Bee Gut Microbiome Bacteria with a Toolkit for Modular Assembly of Broad-Host-Range Plasmids. ACS Synth Biol, 7(5), 1279-1290. doi: 10.1021/acssynbio.7b00399

A CRISPR–Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.

Wissenschaftler des Imperial College London haben einen auf CRISPR basierenden Gene Drive in Anopheles gambiae entwickelt, der auf die Veränderung des Gens doublesex abzielt. Doublesex spielt während der Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle: Es ist entscheidend dafür, ob sich Mücken in Weibchen oder in Männchen entwickeln. Das Resultat der Veränderung ist die Entwicklung von nicht-fruchtbaren Pseudoweibchen und normalen Männchen. Nach etwa 10 Generationen brach die Population im Labor zusammen, es kam zu keiner Resistenzbildung im Ziel-Bereich des Gens.

Kyrou, K., Hammond, A. M., Galizi, R., Kranjc, N., Burt, A., Beaghton, A. K., Crisanti, A. (2018). A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nat Biotechnol. doi: 10.1038/nbt.4245

CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.

Systematische Whole-Genome-Sequencing-Untersuchung des Auftretens von Off-target-Effekten im Erbgut von Mäusen und Ratten nach der Anwendung von CRISPR/Cas. Fazit: Es können Nicht-Zielsequenzbereiche der DNA ungewollt verändert werden. Diese können an nicht vorhersagbaren DNA-Bereichen auftreten, jedoch an relativ wenigen Stellen des Erbguts. Alternative Cas-Nukleasen (wie z.B. Cpf1) und optimierte guide RNAs können das Auftreten dieser Off-target-Effekte reduzieren.

Anderson, K. R., Haeussler, M., Watanabe, C., Janakiraman, V., Lund, J., Modrusan, Z., Warming, S. (2018). CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice. Nat Methods, 15(7), 512-514. doi: 10.1038/s41592-018-0011-5

Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.

Die Verwendung von CRISPR/Cas9 kann zu ungewollten Veränderungen der DNA führen. Im Artikel wird gezeigt, dass durch den Eingriff im Genom zum Beispiel größere DNA-Abschnitte gelöscht, weitere DNA-Sequenzen eingefügt oder ganze DNA-Sequenzen umgedreht werden können. Untersucht wurde dies mit Zellen von Mäusen und menschlichen Zelllinien.

Kosicki, M., Tomberg, K., & Bradley, A. (2018). Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol, 36(8), 765-771. doi: 10.1038/nbt.4192

p53 inhibits CRISPR–Cas9 engineering in human pluripotent stem cells.
CRISPR–Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response.

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), die durch CRISPR/Cas bewirkt wurden oder durch natürliche Prozesse entstehen, führen zur Aktivierung eines „Notfallprogramms“ innerhalb der Zelle. p53 stellt dabei eine zentrale Komponente in der Erkennung von Schäden an der DNA (wie beispielsweise DSBs) dar und kann bei einer Aktivierung in nachfolgenden molekularen Prozessen das Anhalten des Zellzyklus bewirken. Die Aktivierung von p53 hat, wie in den beiden genannten Studien gezeigt, einen Einfluss auf die Effizienz von SDN-2- und SDN-3-Anwendungen von CRISPR/Cas. Bei diesen werden DNA-Vorlagen mit in die Zellen eingeschleust, die als Reparatur-Vorlagen für den Bereich rund um den eingeführten DNA-Bruch dienen. Die DNA-Stücke sind mit dem Zielbereich der DNA bis auf die erwünschte Veränderung der Basen identisch. Zelleigene Reparaturmechanismen (HDR, Homology Directed Repair) erkennen die Reparatur-Vorlage und bauen diese in das Erbgut ein. In den beiden Studien wurde gezeigt, dass in menschlichen Zellen, in denen das Gen p53 ausgeschaltet wurde, die Effizienz, SDN-2- und SDN-3- Veränderungen zu bewirken, erhöht ist. Das Ausschalten des p53-Gens könnte nun möglicherweise gezielt dazu genutzt werden, um die Effizienz von SDN-2- und SDN-3-Anwendungen zu steigern. Hierbei können sich jedoch andere, potentiell schädliche Mutationen im Erbgut anreichern.

Ihry, R. J., Worringer, K. A., Salick, M. R., Frias, E., Ho, D., Theriault, K., Kaykas, A. (2018). p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med, 24(7), 939-946. doi: 10.1038/s41591-018-0050-6 Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., & Taipale, J. (2018). CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med, 24(7), 927-930. doi: 10.1038/s41591-018-0049-z