In diesem Paper wird untersucht, wo genau CRISPR/Cas-Konstrukte in das Erbgut von Sojapflanzen eingebaut werden und wie diese, gemeinsam mit den durch ihre Wirkweise entstandenen Veränderungen, an die nachfolgenden Generation(en) weitergegeben werden.
Interessanterweise geht es dabei nicht nur darum, ob und wie die CRISPR-Genschere im Erbgut schneidet, sondern auch, wo im Erbgut die DNA eingebaut wird, die notwendig ist, um die CRISPR-Genschere zu bilden, bevor sie schneiden kann.
Das CRISPR/Cas-Konstrukt wird zunächst in das Erbgut der Pflanzen eingebaut, damit die Genschere und die guide RNA (gRNA), also der Wegweiser der Genschere, überhaupt gebildet werden können. Dieses CRISPR/Cas-Konstrukt wird in Form von DNA mit Hilfe des Wurzelbakteriums Agrobacterium tumefaciens in die Sojapflanzen eingebracht. Diese sogenannte Agrobacterium-Transformation ist ein gängiger Arbeitsschritt im Labor, um synthetisch hergestellte DNA-Konstrukte in Pflanzenzellen einzuschleusen, und ist eine Methode der alten Gentechnik.
Die Autoren untersuchten nun mit Hilfe von Whole-Genome-Sequencing-Verfahren, an welchen Stellen genau das CRISPR/Cas-Konstrukt eingebaut wurde. Die betreffenden Stellen im Erbgut ähneln sich zu kleinen Anteilen in ihren DNA-Sequenzen, was auch als Mikrohomologie bezeichnet wird. Es scheint also, dass die Integration des CRISPR/Cas-Konstrukts nicht komplett willkürlich stattfindet. Außerdem gibt es mehrere Möglichkeiten, wo im Erbgut das CRISPR/Cas-Konstrukt eingebaut wird: Es kann einmal, mehrfach, an der eigentlichen Zielsequenz oder an anderen Stellen einfügt werden. Durch nachfolgende Rückkreuzungen kann das CRISPR/Cas-Konstrukt dann wieder aus dem Erbgut der Pflanzen entfernt werden.
Die Integration des CRISPR/Cas-Konstruktes kann laut den Ergebnissen dieses Papers nicht vorhergesagt werden und kann in verschiedener Kopienzahl vorkommen. Außerdem zeigen die Analysen des Papers, dass es sinnvoll ist, das gesamte Erbgut der genomeditierten Pflanzen zu sequenzieren (auch genannt Whole-Genome-Sequencing- oder WGS-Verfahren), um die Vererbung der CRISPR/Cas-Konstrukte nachzuverfolgen. Ein Auskreuzen bei mehrfacher Integration der CRISPR/Cas-Konstrukte im Erbgut kann ansonsten schwierig sein.