Pervasive head-to-tail insertions of DNA templates mask desired CRISPR-Cas9-mediated genome editing events

Bei SDN-3-Anwendungen von CRISPR/Cas9 in Mäusen wurde gezeigt, dass DNA-Vorlagen mehrfach innerhalb von Zielsequenzen eingebaut werden und mit einfachen Standardanalyse-Verfahren (PCR, Polymerasekettenreaktion) nicht nachgewiesen werden können. Die Autoren wollten in der Studie Mäuse erschaffen, mit denen ein konditioneller Knockout eines bestimmten Genes möglich wird. Dafür wurden gemeinsam mit der Genschere CRISPR/Cas9 zwei spezifische guide RNAs (Wegweiser der Genschere an die Zielsequenz) und eine DNA-Vorlage durch direkte Injektionen mit in die Mausembryonen eingebracht. Es stellte sich heraus, dass in einem großen Anteil der genomeditierten Nachkommen die DNA-Vorlage mehrfach hintereinander innerhalb der Zielsequenz eingebaut wurde. Derselbe Effekt trat bei weiteren Versuchen wiederholt auf und scheint ein generelles Phänomen bei der Anwendung von CRISPR/Cas9 zu sein. Überraschenderweise war es mit konventionellen PCR-Verfahren nicht möglich, diese Mehrfachintegrationen nachzuweisen, dazu muss der Zielbereich mit verschiedenen PCR-Analysen oder Southern Blotting genauer untersucht werden. Es ist also wichtig, nach einer Genomeditierung den Zielbereich im Erbgut ausführlich nach ungewollt eingebauten DNA-Sequenzen zu untersuchen.