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Rapid customization of Solanaceae fruit crops for urban agriculture

In dieser Publikation werden Tomaten und Physalis vorgestellt, die mit Hilfe der Genschere CRISPR/Cas so verändert wurden, dass sie viel kleiner sind und schneller blühen als andere Tomaten und einen büschelartigen Wuchs haben. Insgesamt wurden bei der Tomate 3 Gene mit der Genschere ausgeschaltet, die für den Blühzeitpunkt, die Länge des Stammes und das Wachstum der Tomatenpflanzen notwendig sind. Solche stark kompaktierten Tomaten sollen laut der Autoren für eine neue Art der Landwirtschaft genutzt werden, die sog. Urban Agriculture. Bei der urbanenrban Landwirtschaft sollen Pflanzen angebaut und Tiere in und um Städte herum gehalten werden. Pflanzen, die einen kleinen Wuchs haben und schnell Früchte tragen, seien somit ideal für den begrenzten Platz zum Anbau in städtischen Regionen. Nicht untersucht werden risikorelevante Fragen nach 1.) prozessbasierten Fehlern von CRISPR/Cas9 wie zum Beispiel das Auftreten von Off-Target-Effekten oder Veränderungen, die durch die Transformation der pflanzlichen Zellen mit dem Agrobacterium tumefaciens ausgelöst werden, und 2.) der Wechselwirkung der neuen Eigenschaften mit dem Stoffwechsel der Pflanzen. Kwon, C. T., Heo, J., Lemmon, Z. H., Capua, Y., Hutton, S. F., Van Eck, J., . . . Lippman, Z. B. (2019). Rapid customization of Solanaceae fruit crops for urban agriculture. Nat Biotechnol. doi:10.1038/s41587-019-0361-2

Viral gene drive in herpesviruses (Preprint Paper)

Bisherige Gene-Drive-Strategien beruhen auf der Weitergabe einer gentechnischen Veränderung in sich sexuell fortpflanzenden Organismen. Laut diesem Artikel ist es Wissenschaftlern nun gelungen, ein neues Gene-Drive-System zu entwickeln, mit dem die Ausbreitung einer bestimmten gentechnischen Veränderung in Populationen von Herpesviren in Zellkulturexperimenten möglich wird. Das Erbgut humaner Cytomegaloviren (CMV) besteht aus doppelsträngiger DNA. Das ist eine Voraussetzung, damit ein Gene Drive, der auf CRISPR/Cas9 basiert, auch funktioniert. Humane CMV infizieren ausschließlich menschliche Zellen. Das Erbgut der Viren liegt im Zellkern der infizierten Zelle als ringförmige DNA vor und wird nicht in das Erbgut des Wirtes (menschliche Zelle) eingebaut. In einem sogenannten latenten Zustand befindet sich das virale Erbgut in einem Ruhezustand, eine aktive Genexpression findet dann kaum statt. Es kann aus dem latenten Zustand (unter Stressbedingungen) reaktiviert werden und wieder anfangen sich zu vermehren. Der Gene Drive funktioniert nur, wenn sich das Virus in der Vermehrungsphase befindet. Während der latenten Ruhephase ist die virale DNA so stark verdichtet, dass die Genschere den Zielbereich nicht schneiden kann. Eine weitere Voraussetzung für einen funktionierenden viralen Gene Drive muss auf jeden Fall erfüllt sein: eine menschliche Zelle muss sowohl mit dem Gene-Drive-Virus als auch dem Wildtyp-Virus infiziert sein, sonst findet der Gene Drive ja die Zielsequenz auf der viralen DNA nicht. Die Gene-Drive-Sequenz (Genschere CRISPR/Cas9 + Wegweiser gRNA + homologe Enden) wird in den infizierten Zellen mit Hilfe des CRISPR/Cas-Systems ausgehend vom Gene-Drive-Virus in das Erbgut des Wildtyp-Virus an einer spezifischen Stelle eingebaut. Damit wird jedoch die Infektiosität oder das Wachstum der neu entstandenen Gene–Drive-Viren nicht verändert. Zunächst ist das Ziel, dass sich die Gene-Drive-Viren in den menschlichen Zellen ausbreiten und zu einer Ko-Infektion mit den Wildtyp-Viren führen. Durch die Zugabe von Interferon gamma (IFN- γ), ein Protein, das während einer menschlichen Immunabwehr gebildet wird, wird die weitere Vermehrung der Gene-Drive-Viren blockiert, da in ihnen ein Gen ausgeschaltet wurde, das sie normalerweise unempfindlich gegenüber IFN- γ macht. Dadurch werden die Gene-Drive-Viren stark in ihrer Ausbreitung beeinträchtigt. Diese Studie ist ein Proof-of-Concept-Paper, das einen Gene Drive beschreibt, der sich in vitro in humanen Zellen, die mit dem viralen (Wildtyp-)CMV infiziert sind, ausbreiten kann. Es müssen jedoch noch weitere Untersuchungen in Bezug auf die Vermischung der Genome der Gene-Drive-Viren und Wildtyp-Viren durchgeführt werden. In diesem Paper wurden relativ wenige Viren, die mit dem Gene Drive verändert wurden, untersucht, zum einen kam es zu recht unterschiedlichen Rekombinationsergebnissen, zum anderen wurden Umlagerungen im viralen Erbgut nachgewiesen. Walter, M., Verdin, E. (2019). Viral gene drive in herpesviruses. BioRxiv, Preprint. doi: https://doi.org/10.1101/717017

Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA

Mit Prime-Editing, einer neuen Variante von CRISPR/Cas, sind Deletionen, Insertionen und alle 12 Möglichkeiten, eine Base enzymatisch in eine andere umzuwandeln, umsetzbar. Beim Prime Editing wird nur ein DNA-Einzelstrang durchtrennt, was das Auftreten von Off-Target-Effekten verringern soll. Außerdem ist das CRISPR/Cas-System so verändert, dass der Wegweiser zur Zielsequenzerkennung, die guide RNA, noch eine zweite Funktion hat: sie dient gleichzeitig auch als Reparaturvorlage, um eine gezielte Veränderung der Zielsequenz herbeizuführen. Dafür wird ein weiteres Enzym, die sogenannte Reverse Transkriptase, an die Genschere geknüpft. Dieses Enzym ist eine Art Übersetzungsprogramm, das die guide RNA in DNA umwandelt. Dieses Stück DNA dient dann als DNA-Vorlage zur Reparatur für den Einzelstrangbruch der DNA und wird an dieser Stelle ins Erbgut kopiert. Die beiden DNA-Stränge an der Zielsequenz passen nun nicht mehr zueinander, weswegen die Genschere auch den nicht veränderten DNA-Einzelstrang schneidet. Die bereits in den veränderten DNA-Einzelstrang kopierte DNA-Vorlage dient anschließend der Reparatur dieses Schnittes. Beim Prime Editing handelt es sich um ein neues Konzept der Anwendung von CRISPR/Cas, das bislang in humanen Zellen angewandt wurde und eine höhere Effizienz bei der Einführung von gezielten Veränderungen der DNA-Zielsequenz verspricht.

Anzalone, A. V., Randolph, P. B., Davis, J. R., Sousa, A. A., Koblan, L. W., Levy, J. M., Liu, D. R. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 576(7785), 149-157. doi:10.1038/s41586-019-1711-4

Plant gene editing through de novo induction of meristems

Die Arbeit mit Zellkulturen stellt bei der Herstellung von transgenen und geneditierten Pflanzen eine Schwachstelle dar: in nur einigen Arten ist es möglich, aus den Zellkulturen neue, veränderte Pflanzen zu entwickeln. Außerdem handelt es sich um einen langwierigen Prozess, bei dem neue und ungewollte Mutationen herbeigeführt werden können. In diesem Artikel wird eine neue Methode vorgestellt, die als Alternative zu der Arbeit mit Gewebe- und Zellkulturen beschrieben wird. Hierdurch sollen schnell geneditierte Pflanzen gewonnen werden können. Am Spross und in der Wurzel befinden sich besondere Bereiche von Pflanzen, die sogenannten Meristeme. Hier teilen sich die Zellen und führen so zum Wachstum und zur Entwicklung der gesamten Pflanze. Wissenschaftler haben nun über das Agrobacterium tumefaciens bestimmte Gene, die die Entwicklung solcher “Teilungszonen” regulieren, in Setzlinge von Tabakpflanzen eingebracht. Das führte dazu, dass sich auf den Setzlingen neue Setzlinge bildeten, die dann eine gentechnische Veränderung in ihrem Erbgut trugen. Dieses System wurde dann so erweitert, dass zusätzlich noch die Genschere CRISPR/Cas gemeinsam mit einer spezifischen gRNA mit in die Tabaksetzlinge eingebracht werden konnte. Mit CRISPR/Cas wurden dann zwei Gene ausgeschaltet, die wichtig für die Bildung von Carotinoiden sind. Dadurch konnten die tatsächlich geneditierten Setzlinge anhand ihrer weißen Farbe identifiziert werden, weil ihnen der grüngebende Farbstoff Chlorophyll fehlte. Einige Setzlinge entwickelten zum Teil sogar Blüten und Samen, die es ermöglichten, die geneditierten Veränderungen an die nächste Generation weiterzugeben. Erfolgreich angewandt wurde dieses Verfahren in Tabak, Kartoffeln, Tomaten und Trauben. Maher, M.F., Nasti, R.A., Vollbrecht, M. et al. Plant gene editing through de novo induction of meristems. Nat Biotechnol 38, 84–89 (2020) doi:10.1038/s41587-019-0337-2

Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes Transfer Genes into a Natural Population

In der Stadt Jacobina (Brasilien) wurden in verschiedenen Stadtteilen von der Firma Oxitec transgene Mücken der Art Aedes aegypti freigelassen. Die Mücken sind gentechnisch so verändert, dass ihre Nachkommen nicht lebensfähig sind. Die natürliche Mückenpopulation sollte dezimiert werden, um damit die Übertragung von Krankheiten wie das Dengue- oder Zika-Fieber zu verringern. WissenschaftlerInnen haben nun untersucht, ob sich Teile des Erbguts von den dort freigesetzten transgenen Mücken in den natürlichen Mückenpopulationen nachweisen lassen. Dafür analysierten sie vor den Freisetzungsversuchen das Erbgut der transgenen Mücken und das Erbgut der natürlichen Mückenpopulationen, die aus verschiedenen Teilen der Stadt Jacobina stammten. 6, 12 und 30 Monate nach der ersten Freisetzung überprüften sie erneut das Genom von eingefangenen Mücken aus denselben Gebieten. Die WissenschaftlerInnen konnten tatsächlich nachweisen, dass Nachkommen der gentechnisch veränderten Mücken überlebt und sich nun Teile ihres Erbguts in natürlichen Populationen von Aedes aegypti befinden. Die Hybride aus transgenen und nicht transgenen Mücken können sich fortpflanzen und auch weiter in der Natur überleben. Je nach Gebiet und Auswertungsparameter finden sich in 10 bis 60% der Mücken Erbgutanteile der transgenen Mücken. Die Zahl der hybriden Mücken nahm innerhalb von 30 Monaten ab, was auf einen möglichen selektiven Nachteil hindeutet. Weitere Untersuchungen seien absolut notwendig, um zu überprüfen, ob die – noch in der Natur vorhandenen – hybriden Mücken unter bestimmten Bedingungen einen Vorteil gegenüber den natürlichen Mücken haben und in der Lage sind, diese zu verdrängen. Mischpopulationen können robuster und vitaler sein als die ursprünglichen Populationen, wie lange sie tatsächlich in der Natur überdauern können, ist völlig unklar. Die langfristigen Folgen dieser Freisetzung transgener Mücken mit Blick auf die Verbreitung von Krankheiten, die Vermehrung der Mücken und den Wechselwirkungen mit der Umwelt sind nicht abschätzbar Evans, B., Kotsakiozi, P., Costa-da-Silva, A., Ioshino, R., Garziera, L., Pedrosa, M., Malavasi, A., Virginio, J., Capurro, M., Powell, J. Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes Transfer Genes into a Natural Population. (2019) Scien Rep. https://doi.org/10.1038/s41598-019-49660-6

Conjugation-dependent ‘gene drives’ harness indigenous bacteria for bioremediation. (Preprint Paper)

Wissenschaftler haben Bakterienstämme im Labor so verändert, dass diese verschiedene Enzyme produzieren, die zum Abbau von Erdölkomponenten führen. Die Versuche zeigten zunächst, dass diese Bakterien Erdöl teilweise besser abbauen können als Bakterienstämme, die natürlicherweise Enzyme produzieren, die diese Stoffe abbauen können.
Als nächstes wurde untersucht, ob das synthetisch hergestellte Erbgut der bakteriellen Laborstämme auf im Boden lebende Bakterien, die natürlicherweise solche Enzyme nicht produzieren, übertragen werden kann. Dafür wurden Boden-Proben gesammelt, die mit Erdöl verunreinigt waren und im Labor mit den synthetischen Bakterienstämmen zusammengebracht. Innerhalb weniger Tage konnte gezeigt werden, dass die natürlicherweise im Boden-lebenden Bakterienstämme ihrerseits nun auch die Enzyme produzieren, also das Erbgut von den gentechnisch veränderten Bakterienstämmen erhalten haben. Damit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass Gentransfer zwischen gentechnisch veränderten Bakterien und in der Natur vorkommende Bodenbakterien stattgefunden hat. Auch noch 90 Tage nachdem die gentechnisch veränderten Bakterien mit der verunreinigten Bodenprobe inkubiert wurden, konnten natürliche Bakterienstämme nachgewiesen werden, die das synthetisch hergestellte Erbgut enthalten. Das zusätzliche Stück DNA verleiht den Bakterien einen Überlebensvorteil, weswegen sich Bakterien damit in natürlichen Populationen ausbreiten. Mit der Ausbreitung solcher gentechnisch veränderten Konstrukte über horizontalen Gentransfer könnten Verunreinigungen mit Erdöl im Boden bekämpft werden. Offen bleiben Fragen rund um die Sicherheit solcher Eingriffe in die Natur: Wie lange können diese transgenen Elemente in der Umwelt Bestand haben? Was passiert, wenn die ursprüngliche Funktion der Enzyme durch natürlicherweise auftretende Mutationen verändert wird? In welchem Maße könnte die natürliche bakterielle Zusammensetzung verändert werden? Und was hätte das dann für Konsequenzen für die Zusammensetzung des Bodens mit Nährstoffen? French, K., Zhou, Z., Terry, N. Conjugation-dependent ‘gene drives’ harness indigenous bacteria for bioremediation (2019) BioRxiv, Preprint; doi: http://dx.doi.org/10.1101/735886

What is the available evidence for the range of applications of genome-editing as a new tool for plant trait modification and the potential occurrence of associated off-target effects: a systematic map.

Bei dem Artikel handelt es sich um einen systematischen Review, der eine Überblick über Publikationen gibt, in denen mit Genome Editing das Erbgut von Pflanzen verändert und das Auftreten von Off-Target-Effekten untersucht wird (im Zeitraum vom Januar 1996 bis einschließlich Mai 2018). Dabei werden sowohl Arbeiten mit Genome-Editing-Verfahren (CRISPR/Cas, TALENs, ZNF, Meganukleasen, ODM und Base Editors) an landwirtschaftlich relevanten Pflanzen als auch Modellorganismen aus der Grundlagenforschung erfasst. Am häufigsten wird CRISPR/Cas verwendet, um kleine Veränderungen am Erbgut – ohne eine Reparaturvorlage einzubringen – herbeizuführen (sogenannte SDN1-Anwendungen). Insgesamt wurden in 99 Arbeiten marktorientierte Veränderungen wie die Erhöhung des agronomischen Wertes oder das Einführen von Stresstoleranzen mit Genome Editing vorgenommen. Bei der Untersuchung von Off-Target-Effekten (OTEs) wurden in den meisten Studien Methoden eingesetzt, die darauf basieren, dass zunächst am Computer (in silico) DNA-Bereiche im Erbgut gesucht werden, die der Zielsequenz sehr ähnlich sind. Die Genscheren können dort unter einer bestimmten Wahrscheinlichkeit falsch schneiden. Nach der Durchführung der Genom-Editierung wird dann gezielt an diesen Bereichen geprüft, ob dort OTEs aufgetreten sind. Insgesamt wurden in 1328 Anwendungen von Genome Editing nur 252 Untersuchungen nach OTEs durchgeführt. Davon wurde bei 211 CRISPR/Cas-Anwendungen an zuvor bestimmten DNA-Bereichen tatsächlich nach OTEs gesucht und auch 55 OTEs gefunden. In nur 9 Studien wurde unvoreingenommen das gesamte Erbgut nach OTEs mit Hilfe von Whole Genome Sequencing (WGS)-Verfahren untersucht. In diesen Untersuchungen wurden keine OTEs gefunden, die mit dem GE-Prozess in Verbindung gebracht werden können. Bei den TALENs wurde insgesamt in nur einer Studie WGS durchgeführt und es wurden 3 OTEs gefunden. Es ist jedoch unklar, ob diese durch die TALENs oder durch spontan auftretende Mutationen entstanden sind. Um eine eindeutige Aussage über das Auftreten von OTEs bei der Anwendung von Genome-Editing-Verfahren treffen zu können, müssen viel mehr unvoreingenommene WGS-Analysen durchgeführt und individuelle Studien in Bezug auf das Auftreten von OTEs kritisch analysiert werden. Modrzejewski , D., Hartung, F., Sprink, T., Krause, D., Kohl, C., Wilhelm R. What is the available evidence for the range of applications of genome-editing as a new tool for plant trait modification and the potential occurrence of associated off-target effects: a systematic map. (2019) Environ Evid. https://doi.org/10.1186/s13750-019-0171-5

An EU Perspective on Biosafety Considerations for Plants Developed by Genome Editing and Other New Genetic Modification Techniques (nGMs).

Das Paper untersucht, welche Risiken von Pflanzen, die mit neuen Gentechniken (NGTs) hergestellt wurden, ausgehen können. Dafür wurde eine Literaturstudie im Zeitraum vom Januar 2011 bis Juni 2017 durchgeführt und dann anhand von marktrelevanten Pflanzen wichtige Aspekte für eine geeignete Risikobewertung diskutiert. Die Autoren schlussfolgern, dass auch minimale Änderungen am Erbgut und die hohe Zieleffizienz der NGTs keine Sicherheitshinweise per se sind, besonders wenn in die Pflanzen neue Eigenschaften eingebracht werden. NGT-Pflanzen können Eigenschaften aufweisen, die bisher nicht durch konventionelle Verfahren oder durch klassische Gentechnik hervorgebracht werden konnten. NGT-Pflanzen mit neuen und bislang ungetesteten Merkmalen können beispielsweise durch die Anwendung von Multiplexing-Ansätzen entstehen und zu komplexen Veränderungen von Stoffwechselwegen führen. Alle untersuchten NGT-Anwendungen können zu unbeabsichtigten Änderungen führen, wie beispielsweise das Auftreten von Off-target-Effekten bei der Verwendung von SDN-Techniken. Außerdem sollten bei der Risikobewertung von NGTs alle verwendeten Techniken betrachtet werden, die zur Herstellung des Endproduktes führen, da auch in den experimentellen Zwischenschritten ungewollte Nebeneffekte auftreten können. Aufgrund der Komplexität der NGTs muss eine geeignete Risikobewertung die Art aller verwendeten Methoden und die Bandbreite der hervorgerufenen Veränderungen berücksichtigen. Deswegen sollte bei Anwendungen neuer Gentechniken eine fallspezifische Risikobewertung erfolgen, die die Eigenschaften der jeweiligen Techniken und der neuen Merkmale einbezieht. Eckerstorfer, M. F., Dolezel, M., Heissenberger, A., Miklau, M., Reichenbecher, W., Steinbrecher, R. A., & Wassmann, F. (2019). An EU Perspective on Biosafety Considerations for Plants Developed by Genome Editing and Other New Genetic Modification Techniques (nGMs). Front Bioeng Biotechnol, 7, 31. doi:10.3389/fbioe.2019.00031 Transgenic Metarhizium rapidly kills mosquitoes in a malaria-endemic region of Burkina Faso. In dieser Studie wurde ein Pilz (Metarhizium pingshaense) so verändert, dass er ein Gift aus einer Trichternetzspinne produziert, sobald er mit der Hämolymphe (das ist das „Blut“ von Mücken und anderen Insekten) in Kontakt kommt. Dieses Gift ist tödlich für Malaria übertragende Anopheles-Mücken und soll der Bekämpfung von Malaria dienen. Der Metarhizium-Pilz befällt (natürlicherweise) als Parasit verschiedene Insekten-Arten und kann bei vielen von ihnen zum Tode führen. Deswegen wird er auch als Insektizid eingesetzt. Seine Sporen werden nicht über die Luft verbreitet, da sie relativ schwer und klebrig sind. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass auch andere Insekten mit dem transgenen Pilz infiziert werden können. Bisher gibt es keine empirischen Daten über eine mögliche Ausbreitung und deren Auswirkung auf Nichtzielorganismen.
In einer sogenannten „Moskito-Sphäre“, einem abgeschlossenen Freilandversuchssystem in Burkina Faso, wurden die transgenen Pilze in großen Untersuchungsbereichen, die mit Netzen von der Umgebung abgetrennt sind, ausgebracht und damit Moskitos infiziert. Untersucht wurden unter anderem die Lebensspanne und die Fruchtbarkeit von Moskitos, die entweder den transgenen, natürlichen oder gar keinen Pilzsporen ausgesetzt wurden. Es zeigte sich, dass Moskitos, die von dem transgenen Pilz befallen wurden, eine drastisch geringere Überlebensrate hatten im Vergleich zu nicht-infizierten und mit dem natürlichen Pilz befallenen Moskitos. Moskito Populationen, die mit den transgenen Pilzporen infiziert wurden, kollabierten nach wenigen Generationen. Die Weibchen legten viel weniger Eier als Weibchen der beiden Kontrollgruppen. Lovett, B., Bilgo, E., Millogo, S. A., Ouattarra, A. K., Sare, I., Gnambani, E. J., St Leger, R. J. (2019). Transgenic Metarhizium rapidly kills mosquitoes in a malaria-endemic region of Burkina Faso. Science, 364(6443), 894-897. doi: 10.1126/science.aaw8737 Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. In dieser Studie wird in verschiedenen menschlichen Zellen systematisch gezeigt, dass Cytosin Base Editors (CBE), die eigentlich in spezifischen Bereichen der DNA Cytosine in Thymine umwandeln sollen, auch viele unbeabsichtigte Veränderungen auf der Ebene der RNA bewirken. Base Editoren beruhen auf einem dead Cas-Enzym, das den Zielbereich der DNA anhand einer guide RNA noch erkennen, aber keine DNA-Doppelstrangbrüche mehr bewirken kann. Die Veränderungen werden durch ein Enzym (hier: rAPOBEC1) bewirkt, das an die dead Cas-Nuklease gekoppelt ist. Die Autoren zeigen hier, dass auf der RNA-Ebene ungewollt vielfach Cytosine in Uracile umgewandelt werden, was dazu führt, dass Proteine anders gebildet werden. Diese ungewollten C-zu-U-Veränderungen auf RNA-Ebene treten unabhängig von unbeabsichtigten Veränderungen der DNA-Ebene auf. Die hier beschriebenen Off-target-Veränderungen der RNA werden unabhängig von der jeweiligen guide RNA bewirkt, sondern durch eine zusätzliche Aktivität des Base Editors. Durch Mutationen im Base Editor soll die ungewollte RNA-Aktivität vermindert und die Aktivität auf der DNA-Ebene beibehalten werden. Auch bei Adenosin Base Editors (ABEs), die eine Umwandlung von A nach G bewirken, werden diese Art von Off-target-Effekten auf der RNA-Ebene gefunden. Grunewald, J., Zhou, R., Garcia, S. P., Iyer, S., Lareau, C. A., Aryee, M. J., & Joung, J. K. (2019). Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature, 569(7756), 433-437. doi: 10.1038/s41586-019-1161-z Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Proteine sind aus 20 verschiedenen Aminosäuren zusammengesetzt. Diese 20 Aminosäuren werden natürlicherweise durch insgesamt 64 Codons festgelegt. Dabei kodieren drei Basenpaare der DNA (=Codon) jeweils für eine Aminosäure. 18 Aminosäuren besitzen mehr als ein Codon, was beispielsweise Einfluss auf die Gen-Expression haben kann. In dieser Studie wurde nun ein Escherichia coli-Stamm mit einem komplett synthetisch hergestellten Erbgut beschrieben, bei dem 3 Codons aus dem gesamten Erbgut entfernt wurden, so dass dieser nur noch 61 Codons trägt. Der E.coli-Stamm wurde passenderweise „Syn61“ benannt und umfasst mit ungefähr 4 Mb das bisher größte künstlich hergestellte Erbgut. Syn61-Bakterien, im Vergleich zum ursprünglichen E.coli– Stamm, wachsen langsamer, sind länger und zeigen Veränderungen in der Bildung von Proteinen. In weiteren Untersuchungen wollen die Wissenschaftler das neu kodierte Bakterium für die Herstellung von Biopolymeren verwenden. Fredens, J., Wang, K., de la Torre, D., Funke, L. F. H., Robertson, W. E., Christova, Y., Chin, J. W. (2019). Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature. doi: 10.1038/s41586-019-1192-5 Linking CRISPR-Cas9 interference in cassava to the evolution of editing-resistant geminiviruses. Cassava-Pflanzen wurden so verändert, dass sie die Genschere Cas9 und eine gRNA dauerhaft bilden und damit resistent gegen Geminiviren sein sollten. Diese Pflanzen waren aber nicht resistent, sondern setzten ihrerseits Viren frei, die gegen die Cas9-Aktivität durch Mutationen immun geworden waren. Diese neu entstandenen Viren könnten als Übergang zur Entstehung neuer pathogener Viren fungieren. Mehta, D., Sturchler, A., Anjanappa, R. B., Zaidi, S. S., Hirsch-Hoffmann, M., Gruissem, W., & Vanderschuren, H. (2019). Linking CRISPR-Cas9 interference in cassava to the evolution of editing-resistant geminiviruses. Genome Biol, 20(1), 80. doi: 10.1186/s13059-019-1678-3 Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Diese Studie nutzt Whole Genome Sequencing (WGS) Methoden, um die Spezifität von sogenannten Base Editors im Reis zu analysieren. Es zeigte sich, dass CBE’s viel mehr ungewollte Veränderungen (C in T Umwandlungen) im Erbgut verursachten als die ABE’s und als in den Kontrollgruppen identifiziert wurden. Diese Veränderungen wurden über das gesamte Erbgut hinweg verteilt gefunden, vor allem angereichert in aktiv abgelesenen Gen-Bereichen. Interessanterweise zeigte sich, dass die ungewollten Veränderungen an willkürlichen Stellen des Genoms eingeführt wurden und nicht an Stellen, die durch Computerprogramme als mögliche off-target Bereiche prognostiziert wurden. Jin, S., Zong, Y., Gao, Q., Zhu, Z., Wang, Y., Qin, P., Gao, C. (2019). Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. doi: 10.1126/science.aaw7166 Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Diese Studie ist vom Versuchsaufbau her sehr elegant konzipiert. Die jeweiligen Komponenten der Base Editors werden in eine von zwei Zellen im 2-Zell-Stadium des Maus-Embryos injiziert. Somit können nach einigen Zellteilungen Genom editierte und unveränderte Zellen mit demselben genetischen Hintergrund untersucht und miteinander verglichen werden. Hierbei zeigte sich bei der Sequenzierung des Erbguts (Whole Genome Sequencing, WGS), dass Zellen, die mit Cytosine Base Editors behandelt wurden, 20x mehr ungewollte Veränderungen im Erbgut hervorrufen als Adenin Base Editors und im Vergleich mit den Kontrollgruppen. Zuo, E., Sun, Y., Wei, W., Yuan, T., Ying, W., Sun, H., Yang, H. (2019). Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. doi: 10.1126/science.aav9973 The complex architecture and epigenomic impact of plant T-DNA insertions. Mit Hilfe von neuen Sequenzierungsmethoden, die es ermöglichen, sehr große DNA-Bereiche des Erbguts zu entschlüsseln, ist es Wissenschaftlern gelungen, nach einer Agrobacterium-Transformation in Arabidopsis thaliana und T-DNA-Integration weit entfernte DNA-Regionen auf strukturelle Unregelmäßigkeiten und ungewollte Veränderungen der DNA-Sequenz hin zu untersuchen. Offenbar kann es bei der Integration der T-DNA dazu kommen, dass große Teile der pflanzlichen DNA ungewollt durch die T-DNA-Integration umgebaut und Inversionen, Deletionen und Insertionen im Erbgut hervorgerufen werden. Weiterhin konnten die Wissenschaftler zeigen, dass es zu Veränderungen von epigenetischen Markern im Bereich der Integrationsstelle der T-DNA kommen kann, was zu einer veränderten Genexpression führen kann. Jupe, F., Rivkin, A. C., Michael, T. P., Zander, M., Motley, S. T., Sandoval, J. P., Ecker, J. R. (2019). The complex architecture and epigenomic impact of plant T-DNA insertions. PLoS Genet, 15(1), e1007819. doi: 10.1371/journal.pgen.1007819 CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Delta-Proteobakterien, die im Grundwasser vorkommen, besitzen eine Cas-Variante, die unabhängig von den bisher am häufigsten verwendeten Genscheren Cas9 oder Cpf1 entstanden ist. Die neue Genschere CasX ist viel kleiner, erkennt eine charakteristische PAM-Sequenz (TTCN) auf dem Erbgut und hat strukturell bis auf eine Schneidekomponente nur wenig Ähnlichkeit mit den anderen beiden Genscheren. Dennoch haben alle drei dieselbe molekulare Wirkung: durch eine Erkennungskomponente, die guide RNA, wird eine Zielsequenz auf der DNA erkannt und von den Genscheren geschnitten. CasX schneidet, ähnlich wie Cas9, doppelsträngige DNA, jedoch wird die DNA nicht glatt zerschnitten, sondern es entstehen versetzte DNA-Enden. Es wird vermutet, dass hierdurch die Spezifität der Editierung erhöht wird. Im direkten Vergleich liegt die Effizienz in der Veränderung von Zielsequenzen durch Cas9 aber noch deutlich über der von CasX. Liu, J. J., Orlova, N., Oakes, B. L., Ma, E., Spinner, H. B., Baney, K. L. M., Doudna, J. A. (2019). CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature. doi: 10.1038/s41586-019-0908-x De novo domestication of wild tomato using genome editing. In dieser Studie werden in einer wilden Tomatenart durch CRISPR/Cas9 sechs Gene verändert, die sich als wichtig für den Ertrag und den Nährstoffgehalt von domestizierten Tomaten erwiesen haben. Diese Wild-Tomaten tragen Eigenschaften wie Stress-Toleranz und Krankheitsresistenzen im Erbgut, die im Zuge der Zucht verloren gegangen sind. Durch die Editierung von sechs Genen wurden die Wild-Tomaten in ihrer Form, Größe, der Anzahl der Früchte und dem Nährstoffgehalt verändert. Zsogon, A., Cermak, T., Naves, E. R., Notini, M. M., Edel, K. H., Weinl, S.,Peres, L. E. P. (2018). De novo domestication of wild tomato using genome editing. Nat Biotechnol. Kinetics and Fidelity of the Repair of Cas9-Induced Double-Strand DNA Breaks. Hier wird in menschlichen Zellen die Geschwindigkeit der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) modelliert, die durch CRISPR/Cas9 bewirkt wurden. Die Reparatur der DSB verläuft insgesamt recht langsam und führt überwiegend zu Veränderungen der Zielsequenz, anstatt den Normalzustand wiederherzustellen. Brinkman, E. K., Chen, T., de Haas, M., Holland, H. A., Akhtar, W., & van Steensel, B. (2018). Kinetics and Fidelity of the Repair of Cas9-Induced Double-Strand DNA Breaks. Mol Cell, 70(5), 801-813 e806. doi: 10.1016/j.molcel.2018.04.016 Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome. Nahezu vollständige Sequenzierung des Erbguts des hexaploiden Weizens durch das IWGSC (International Wheat Genome Sequencing Consortium). Diese Publikation liefert ein Referenzgenom der Weizen-Sorte Chinese Spring. International Wheat Genome Sequencing, C., investigators, I. R. p., Appels, R., Eversole, K., Feuillet, C., Keller, B., Uauy, C. (2018). Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome. Science, 361(6403). doi: 10.1126/science.aar7191 RNA virus interference via CRISPR/Cas13a system in plants. Hier wurde das CRISPR/Cas13a-System auf Tabakpflanzen übertragen, so dass die Pflanzen bei einer Infektion mit dem Turnip Mosaic Virus (TuMV) das virale Erbgut in Form von RNA erkennen und zerschneiden können. Das CRISPR/Cas13-System wurde hier zum ersten Mal dazu verwendet, Pflanzen zu entwickeln, die sich vor einem eindringenden RNA-Virus schützen können. Aman, R., Ali, Z., Butt, H., Mahas, A., Aljedaani, F., Khan, M. Z., Mahfouz, M. (2018). RNA virus interference via CRISPR/Cas13a system in plants. Genome Biol, 19(1), 1. doi: 10.1186/s13059-017-1381-1 Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. In diesem Artikel werden Verfahren, Werkzeuge und Marker vorgestellt, um das Erbgut in Bakterien, die mit Honigbienen und Hummeln assoziiert sind, zu verändern (das Mikrobiom). Leonard, S. P., Perutka, J., Powell, J. E., Geng, P., Richhart, D. D., Byrom, M., Barrick, J. E. (2018). Genetic Engineering of Bee Gut Microbiome Bacteria with a Toolkit for Modular Assembly of Broad-Host-Range Plasmids. ACS Synth Biol, 7(5), 1279-1290. doi: 10.1021/acssynbio.7b00399 A CRISPR–Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Wissenschaftler des Imperial College London haben einen auf CRISPR basierenden Gene Drive in Anopheles gambiae entwickelt, der auf die Veränderung des Gens doublesex abzielt. Doublesex spielt während der Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle: Es ist entscheidend dafür, ob sich Mücken in Weibchen oder in Männchen entwickeln. Das Resultat der Veränderung ist die Entwicklung von nicht-fruchtbaren Pseudoweibchen und normalen Männchen. Nach etwa 10 Generationen brach die Population im Labor zusammen, es kam zu keiner Resistenzbildung im Ziel-Bereich des Gens. Kyrou, K., Hammond, A. M., Galizi, R., Kranjc, N., Burt, A., Beaghton, A. K., Crisanti, A. (2018). A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nat Biotechnol. doi: 10.1038/nbt.4245 CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice. Systematische Whole-Genome-Sequencing-Untersuchung des Auftretens von Off-target-Effekten im Erbgut von Mäusen und Ratten nach der Anwendung von CRISPR/Cas. Fazit: Es können Nicht-Zielsequenzbereiche der DNA ungewollt verändert werden. Diese können an nicht vorhersagbaren DNA-Bereichen auftreten, jedoch an relativ wenigen Stellen des Erbguts. Alternative Cas-Nukleasen (wie z.B. Cpf1) und optimierte guide RNAs können das Auftreten dieser Off-target-Effekte reduzieren. Anderson, K. R., Haeussler, M., Watanabe, C., Janakiraman, V., Lund, J., Modrusan, Z., Warming, S. (2018). CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice. Nat Methods, 15(7), 512-514. doi: 10.1038/s41592-018-0011-5 Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Die Verwendung von CRISPR/Cas9 kann zu ungewollten Veränderungen der DNA führen. Im Artikel wird gezeigt, dass durch den Eingriff im Genom zum Beispiel größere DNA-Abschnitte gelöscht, weitere DNA-Sequenzen eingefügt oder ganze DNA-Sequenzen umgedreht werden können. Untersucht wurde dies mit Zellen von Mäusen und menschlichen Zelllinien. Kosicki, M., Tomberg, K., & Bradley, A. (2018). Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol, 36(8), 765-771. doi: 10.1038/nbt.4192 p53 inhibits CRISPR–Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. CRISPR–Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), die durch CRISPR/Cas bewirkt wurden oder durch natürliche Prozesse entstehen, führen zur Aktivierung eines „Notfallprogramms“ innerhalb der Zelle. p53 stellt dabei eine zentrale Komponente in der Erkennung von Schäden an der DNA (wie beispielsweise DSBs) dar und kann bei einer Aktivierung in nachfolgenden molekularen Prozessen das Anhalten des Zellzyklus bewirken. Die Aktivierung von p53 hat, wie in den beiden genannten Studien gezeigt, einen Einfluss auf die Effizienz von SDN-2- und SDN-3-Anwendungen von CRISPR/Cas. Bei diesen werden DNA-Vorlagen mit in die Zellen eingeschleust, die als Reparatur-Vorlagen für den Bereich rund um den eingeführten DNA-Bruch dienen. Die DNA-Stücke sind mit dem Zielbereich der DNA bis auf die erwünschte Veränderung der Basen identisch. Zelleigene Reparaturmechanismen (HDR, Homology Directed Repair) erkennen die Reparatur-Vorlage und bauen diese in das Erbgut ein. In den beiden Studien wurde gezeigt, dass in menschlichen Zellen, in denen das Gen p53 ausgeschaltet wurde, die Effizienz, SDN-2- und SDN-3- Veränderungen zu bewirken, erhöht ist. Das Ausschalten des p53-Gens könnte nun möglicherweise gezielt dazu genutzt werden, um die Effizienz von SDN-2- und SDN-3-Anwendungen zu steigern. Hierbei können sich jedoch andere, potentiell schädliche Mutationen im Erbgut anreichern. Ihry, R. J., Worringer, K. A., Salick, M. R., Frias, E., Ho, D., Theriault, K., Kaykas, A. (2018). p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med, 24(7), 939-946. doi: 10.1038/s41591-018-0050-6 Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., & Taipale, J. (2018). CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med, 24(7), 927-930. doi: 10.1038/s41591-018-0049-z